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RNA pull down 检测

RNA pull down：RNA沉淀检测，是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要实验方法之一。使用体外转录将RNA进行生物素标记，并与细胞蛋白裂解液孵育，形成RNA-蛋白复合物。复合物通过磁珠结合后分离，复合物纯化洗脱后通过Western blot验证检测特性的蛋白。若筛选可能结合的蛋白通过质谱实验进行检测筛选。目前常用的RNA干扰手段为miRNA、shRNA和siRNA等。

RNA提取及注意事项

研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞中分离纯化RNA。RNA质量的高低经常影响RT-PCR、cDNA库构建和Northern Blot等分子生物学实验的成败。

主要试剂

Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。

1.

Trizol试剂含有，具有毒性和刺激性，注重操作。

2.

RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉，注重配带手套，样品尽可能盖严。

3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低后得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。在清洗和裂解细胞时在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。

4. 酵母和一些细菌由于细胞壁的特别结构，可以加入Trizol试剂同时加入无RNase的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分。

2-8℃ 避光保存一年。

20.Primer设计的基本原则是什么？

答：引物设计的下列原则供您参考。

◆引物长度一般在18-35mer。

◆G-C含量控制在40-60%左右。

◆避免近3'端有酶切位点或发夹结构。

◆如果可能避免在3'端5个碱基有2个以上的G或C。

◆如果可能避免在3'端1个碱基为A。

◆避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。

◆退火温度Tm控制在 58-60C 左右。

◆如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。

21.为什么引物的OD260/OD280小于1.5 ？

答：引物应该全是DNA，但是OD260/OD280的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如纤维素薄膜或PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。需要指出的是OD260/OD280的比值不能用来衡量引物的纯度。OD260/OD280的比值过低一般是由于引物中C/T 的含量比较高所致。下表是一个20mer 同聚体引物的OD260/OD280的比值，清楚表明OD260/OD280的比值与引物的碱基组成密切相关。